基于mNGS技术鉴定粪肠球菌引起的尿路感染
导读
近年来，随着生物信息的快速发展及样本采集制备的流程优化， 宏基因组下一代测序（mNGS） 已经逐渐展露出其在临床上的应用价值。在传统培养和血清学检测均为阴性的情况下，运用mNGS技术可以获得全面的病原微生物信息，帮助医生更好地评估疾病的感染原和病因。
上海交通大学附属第六人民医院重症医学科 李颖川教授 团队 、 复旦大学公共卫生学院 陆一涵 教 授 团队在 《 BMC Infectious Diseases 》（ IF= 2.688 ） 发表了一篇 关于宏基因组二代测序在尿路感染患者中的应用的学术成果，初步证明 宏基因组下一代测序（mNGS）在尿路感染诊断中的应用潜能，以及mNGS在监测疾病进展和评估治疗疗效方面的应用价值。
研究内容
患者，33岁，男性，因发高烧和下腹疼痛1天而入院。入院前，患者全身发冷，体温升至39.6 °C ，口服感冒药并休息几个小时后症状无明显缓解，体温未下降。
入院后检查，血常规显示白细胞计数为22.69×10 9 /L，中性粒细胞占比92.6％。降钙素原（PCT）水平升高至4.52ng/mL，C反应蛋白（CRP）达到170mg/L，血清白介素6高达34.74pg/mL（图 1 ）；肝肾功能基本正常；常规自身免疫性疾病相关指标均为阴性；免疫功能及与甲状腺功能相关指标均正常；尿常规检测各项指标正常，其中包括尿液中白细胞数量；超声心动图排除心内膜炎的可能。 根据临床以往的经验，初步诊断为不明原因感染。 予舒普深(3 g/8hiv)和甲硝唑(0.5 g/12 hiv)经验性用药三天，寒战症状消失，但仍有间歇性发热，高烧体温最高可达38.8℃。
呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体和嗜肺军团菌等特异性抗体血清学检测结果均为阴性。取患者外周血及尿液样本同时进行培养和mNGS检测。经过5天的培养，外周血和尿液样本均无好氧菌和厌氧菌生长。然而，mNGS仅经24小时即在尿液样本中检出粪肠球菌163条unique reads（表1），mNGS检测共获得27831980条reads，其中粪肠球菌相对丰度11.15%。随后，通过sanger测序、PCR电泳及QPCR实验证实了尿液样本中粪肠球菌的存在(图2)。此外，对患者的病史进行详细询问，了解到患者2015年腹部查出肠系膜囊肿。对患者进行全腹部CT扫描，检查结果显示腹腔肠系膜间隙存在囊性肿块，最大横断面18×7cm，右肾有小结石（图3）。
上述信息提示， 患者可能存在尿路感染，粪肠球菌是主要诱因。 根据mNGS检测结果，更换利奈唑胺(0.6 g/1 2 hpo)进行治疗，患者体温逐渐下降，炎症指标(WBC、PCT、CRP)也逐步恢复正常。三天后，患者出院，无任何并发症。
患者出院后的第11天，再次取尿液样本进行mNGS检测，测序共获得15974,870条reads，其中粪肠球菌的unique reads数减少到2条（表1），相对丰度从11.15%降低到0.27%， 提示粪肠球菌显著减少，表明治疗有效，与患者实际表现相符。
肠球菌属是一类通常存在于人类胃肠道、口腔或阴道的细菌。 粪肠球菌和屎肠球菌是临床样本中分离出的两种最常见的肠球菌。 一项调查表明，大约80%的人类感染中可以发现粪肠球菌，它是世界范围内引起人类感染的主要原因之一。 近年来，粪肠球菌引起的尿路感染的发病率大约是屎肠球菌的5倍。 在这个案例中，病人泌尿系统存在结石，理论上，一旦细菌侵入了尿道并促成了尿结石的形成，很容易触发尿路感染，并进一步发展为慢性肾盂肾炎。 除粪肠球菌外，患者尿液中还检测到JC多瘤病毒（JC polyomavirus）和人疱疹病毒6（human herpesvirus 6），因为两者通常引起无症状的持续性或潜伏性感染，所以不认为它们引起了尿路感染。
总结
mNGS作为一种无偏倚的快速诊断病原体方法，克服了传统检测方法的诸多不足，直接对样本进行DNA或RNA进行测序，在临床中应用的越来越广泛。mNGS用单一的实验取代临床多种目标病原体检测，可针对样本中的所有病原体(细菌、真菌、病毒和寄生虫)，而不需要医生预先判断。 因此，对于一些罕见或未知病原体的诊断和鉴定，mNGS具有明显的优势。 另外，它可以适用 多种样本类型 ，包括外周血、脑脊液、组织、痰液、支气管肺泡灌洗液等，在脓毒症、免疫抑制宿主合并严重感染、严重肺部感染、罕见或新病原体感染等疾病中， 能够大大缩短病原菌鉴定的周转时间，在24-48h内快速有效地识别样本中病原体，且比培养方法更敏感，提高临床诊断率。
mNGS在临床应用中也存在一些挑战。首先，在检测出的各物种中，较难区分定植菌、背景菌和致病菌，所以有必要在实验过程中对同一批次样本设置阴性对照样本，并在前期通过大样本量检测结果的积累来区分背景菌。其次是宿主核酸背景问题。样本中超过99%的核酸来自人类宿主，微生物只占很小的比例，直接对样本的总核酸进行测序会因微生物数据占比较低而影响病原体鉴定的敏感性。因此，在湿实验过程中，通过一定的技术手段特异性去除人源核酸，提高微生物核酸占比进而提高测序所得的微生物数据量显得较为必要 。
mNGS作为一种新的不依赖培养的方法，显示了快速、敏感和准确的病原体鉴定能力，这项技术为临床医生制定精准的治疗方案提供了强有力的支持。相信在不久的将来，mNGS将越来越广泛地应用于临床，使更多的医生和患者受益。
*该研究使用了迪飞医学mNGS检测产品
参考文献：Li Manshi, Yang Fuhuo, Lu Yihan et al. BMC Infectious Diseases. 2020, 20: 467.
